自 1972 年，基因疗法这一概念提出以来，该领域已经发展了近 50 个年头，期间历经起伏。1999 年，杰西・盖尔新格（Jesse Gelsinger）在接受宾夕法尼亚大学詹姆斯・威尔逊（James Wilson）教授实验室主导下的基因疗法治疗后死亡，曾为这一领域按下暂停键。在数十年的沉寂中，詹姆斯缩减了实验室规模，潜心寻找更安全的基因治疗载体，他发现了一种腺相关病毒载体（AAV）。在杰西死亡事件的阴霾下，这无疑是涅槃重生。现在，有超过三分之二的基因疗法公司都在使用詹姆斯实验室发现的载体，詹姆斯创立的 AAV 公司 Regenxbio 价值近 20 亿美元。2017 年，诺华和 Kite 的体外基因治疗 CAR-T 产品相继获批上市，将基因疗法这一领域推上了研发热浪。基因治疗领域发展迅速，以至于人们忘记了杰西事件，2020 年，以 AAV 为载体的体内基因疗法试验中有 4 名患者死亡，再次敲响了警钟。一直以来，AAV 因其安全性好、免疫原性低、宿主细胞范围广、表达外源基因时间长等特点被广泛应用于基因疗法药物递送。但现在来看，这一 “安全神话” 似乎要破灭。该领域诸多公司也在就这些问题进行探索，就在近期，诸多研究人员就体内基因治疗出现的问题带来了自己的见解，且看他们会碰撞出什么样的火花？埃里克・凯尔西奇（Eric Kelsic）拥有加州理工学院物理学学士学位，他对一切难题充满兴趣并拥有 DNA 合成和测序的背景，在乔治・丘奇 (George Church) 实验室做博士后期间，他建立了一个能够用 AI 系统优化 AAV 衣壳的平台，该平台可以对一种特定 AAV 血清型的所有衣壳变体进行高通量筛选。根据衣壳的不同，AAV 可以分为不同的血清型，不同的血清型 AAV 拥有不同的组织定向性和表达效率，目前，已发现了十数种 AAV 血清型。2020 年 5 月，依托 AI 优化 AAV 衣壳平台，埃里克创建的基因疗法公司 Dyno Therapeutics 走出隐匿模式，尽管只完成了 900 万美元的种子轮融资，但该公司迅速与罕见病巨头 Sarepta Therapeutics、诺华、罗氏签订了合作协议，分别开发用于肌肉疾病、眼疾、中枢神经疾病及肝定向疗法的基因疗法载体。如果 Dyno 成功开发出更安全的下一代基因治疗载体，将有可能获得上述公司带来的高达 40 亿美元的里程碑付款。目前，Dyno 的的工作仍处于临床前阶段。
图 | 埃里克・凯尔西奇（来源：Dyno Therapeutics）“现在，Dyno 所做的事情很新颖，但 5 年后所有公司都可以做到”，基因治疗初创公司 Shape Therapeutics 的首席执行官弗朗索瓦・维格诺 Francois Vigneault 表示。但并不是每一个人都看好。卢克・范登伯格（Luk Vandenberghe）是马赛诸塞州眼耳医院基因治疗中心的负责人，他认为，“该领域在开发携带大片段基因以及躲避中和抗体的载体方面能力很薄弱”。中和抗体是一种与病原体结合的抗体，这种抗体会干扰 AAV 靶向病原体，降低基因治疗的效果。罕见病基因疗法公司 Spark Therapeutics 的首席科学官费德里科・明戈齐 Federico Mingozzi 已经成功开发了一种能够切除病人体内中和抗体的酶。该公司开发的 Luxturna 成为首个获得 FDA 批准的 AAV 的基因疗法，用于治疗视网膜营养不良症。卢克创立的基因治疗公司 Affinia Therapeutics 利用专有的 AAV 文库和技术改造病毒衣壳蛋白的免疫原性和组织定向性，该公司聚焦于中枢神经疾病和肌肉疾病，在 2020 年 4 月的时候，该公司和 Vertex 达成高达 16 亿美元的合作，共同设计 AAV 衣壳，开发用于治疗囊性纤维化和杜氏肌营养不良症的基因疗法。卢克也尝试了埃里克所使用的 AI 优化 AAV 衣壳的方式，但他们失败了，因此，卢克对于埃里克是否有足够的知识用 AI 改造优化 AAV 衣壳蛋白表示怀疑。基因治疗公司 Encoded Therapeutics 等公司则在设计一种启动子，以控制 AAV 载体的组织定向性以及 DNA 序列的表达。麻省大学的基因疗法教授罗伯特・科汀（Robert Kotin）研究 AAV 时间长达 20 年，尽管他参与发现了 AAV4 和 AAV5 中两种常用的血清型，但他不认为衣壳会起什么作用。“我们认为衣壳是无聊的，一直都是，它们没什么作用，细胞会限制它们”，罗伯特表示。早在 10 年前，罗伯特和另外一名科学家 Lina Li 在改善 AAV 制造过程中发现了一种用封闭 DNA（ceDNA）递送基因片段的方式，这种 DNA 能够从细胞质进入细胞核，并在细胞核中停留表达，这意味着，在没有病毒载体的情况下，也可以进行基因递送。2016 年，美国生命科学领域风投公司 Atlas Venture 的合伙人杰森・罗德斯 Jason Rhodes 注意到了罗伯特的工作，并推出了 Generation Bio 公司，利用这种非病毒的方式能够将大型甚至多个基因靶向特定的细胞，因此，这种方式能够治疗更罕见难治的疾病。图 | 非病毒基因治疗平台（来源：Generation Bio）“这种方式不会取代 AAV，而是一种完全不同的生物疗法”，Generation Bio 的首席执行官杰夫・麦克唐纳（Geoff McDonough）表示。但有些专家怀疑这种方式是否拥有 AAV 的组织定向能力以及达到 AAV 的表达水平。这种怀疑不是空穴来风，根据 Generation Bio 发布的猴子试验数据，用脂质纳米颗粒将 DNA 载体递送到体内后，并不会产生用 AAV 载体递送时相同的表达量。但杰夫声称这是他们之前的载体递送数据，现在已经改造了。目前，该公司主要解决肝脏和视网膜疾病，布局的 8 条管线均处于临床前阶段。基于目前出现的问题，一些专家认为，未来是否会依赖于 AAV 还不确定，很多公司在积极探索新的方向。2019 年，美国波士顿风投机构 Flagship Pioneering 推出了一家利用指环病毒作为载体的基因治疗公司 Ring Therapeutics。该公司的首席执行官 Tuyen Ong 认为，这种病毒能够定向到人体特定的部位，并且无免疫原性，“这至少消除了两个关键的 AAV 障碍”，即组织定向性和免疫原性。图 | 指环病毒（来源：Ring Therapeutics）但问题在于，指环病毒比 AAV 还要小，会限制其在临床中的应用。“这不会是最终的解决方式，但是还有很多病毒有待探索”。Beam Therapeutics 的首席科学官 朱塞佩・拉米尔拉（Giuseppe Ciaramella） 说道。细胞和基因疗法初创公司 Sana Biotechnology 也在积极解决基因递送和免疫原性的问题，他们开发了一种 “融合技术”，即用工程化的手段改造自然界发现的蛋白质，Sana 声称这项技术可以容纳两倍于 AAV 大小的基因，并且可以定位到任何的细胞类型中。目前，Sana 布局的管线潜在的适应症涵盖肿瘤、肝脏相关遗传疾病、血红蛋白病、糖尿病、中枢神经及心血管疾病等。虽然该公司创立于 2018 年，布局的 10 多条管线均处于临床前阶段，但就在前些日子，Sana 已经提交了 IPO 文件，据外媒预估，Sana 公司 IPO 之后的估值将高达 90-120 亿美元，一旦上市，会成为有史以来最高估值的临床前生物制药公司。尽管最近 AAV 临床试验波折众多，但机遇和挑战并存，很多产业界及投资界的人依旧看好。2020 年年底，礼来斥资 10 亿美元收购了基因治疗公司 Prevail，同时获得了 Prevail 三种用于治疗神经疾病的基于 AAV9 的基因疗法；Taysha 筹集了 2.82 亿美元资金用于在中枢神经系统中推进 18 种不同的基于 AAV9 的基因疗法。Taysha 的首席执行官 RA Sessions 认为：“我们挖掘到的 AAV9 的潜力仅有冰山一角。”大量玩家涌进该赛道也为 CDMO 公司创造了机遇。查询 ClinicalTrials.gov，目前有超过 4000 项基因治疗试验处于临床阶段，有超过 270 项与 AAV 相关的临床试验。但大量初创公司为 CDMO 公司送去订单的同时，FDA 也面对着质量监控问题。高剂量也是最主要的致死原因。在 2020 年发生的 4 例致死病例中，其中 3 例来自于日本制药公司安斯泰来（TYO: 4503，Astellas）的子公司 Audentes Therapeutics ，虽然患者分别死于败血症和胃肠道出血，但根本原因是因为接受了高剂量的治疗。同年，在 11 月份的 AAV 研究人员年度大会上，FDA 的皮特・马克斯（Peter Marks）敦促该领域专注于最实际的解决方案。在为期两天的活动中，他们研究了 Audentes 临床试验中的诸多细节问题，包括该公司如何低估了患者实际注射的病毒数量，同时讨论了医生提供的免疫抑制方案。
目前，并没有找到两全其美的方法，Audentes 的选择我们也早已知道：降低剂量，并在 2020 年 12 月份恢复了临床试验。皮特说道：“很显然，未来会有除了 AAV 以外的方式，但现在 AAV 依旧是基因治疗领域的主力军，我们应该尝试最大程度地使用它。”参考资料：
https://endpts.com/after-3-deaths-rock-the-field-gene-therapy-researchers-contemplate-aavs-future/
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